GIPC调节通过整合素b1调节IGFBP3促进体外肝星状细胞迁移和体内门静脉高压

文章标题：GIPC-Regulated IGFBP-3 Promotes HSC Migration In Vitro and Portal Hypertension In Vivo Through a b1-Integrin Pathway
期刊：Cellular and molecular gastroenterology and hepatology
DOI:10.1016/j.jcmgh.2020.05.005
Pubmed ID: 32447051

Summary

Insulin-like growth factor binding protein-3 is a transforming growth factor-b–responsive gene that is regulated

transcriptionally by GAIP interacting protein C-terminus. It promotes hepatic stellate cell migration through integrin

and protein kinase B dependent pathway leading to portal hypertension in vivo.

胰岛素样生长因子结合蛋白-3是一个转化的生长因子-b应答基因，由GAIP相互作用蛋白c端转录调控。它通过整合素和蛋白激酶B依赖途径促进肝星状细胞迁移，导致体内门脉高压症。

Abstract

转化生长因子(TGF-b)诱导的静止肝星状细胞(HSCs)的激活及其转化为肌成纤维细胞是肝纤维化和门脉高压症的关键事件。GIPC(也称为synectin)是TGF-b和其他受体的下游信号激活分子。

方法：mRNA测序分析TGF-b激活的HSC以及GIPC敲除的HSC细胞。发现了IGFBP-3这个靶点基因。然后进行了PCR, ELISA，染色质免疫沉淀，WB实验等。

结果：IGFBP3是TGF-b及GIPC的top激活靶点，然后通过PCR，ELISA及WB证实了。染色质免疫沉淀发现GIPC促进了H3K27乙酰化，抑制H3K27三甲基化，提供了一个表观遗传相关的基因调控变化。在体内，IGFBP-3小鼠的整体敲除导致慢性肝损伤模型中HSC激活标志物的衰减和门脉压力的降低。肝硬化的病人血清中可以检测出超过2倍正常对照水平的IGFBP-3。体外实验表明IGFBP-3通过整合素依赖的蛋白激酶B磷酸化促进星状细胞迁移。

结论：TGF-b通过GIPC上调IGFBP-3，导致体外星状细胞迁移增加，体内门脉高压升高。这些研究支持IGFBP-3作为慢性肝病潜在的病理生理学靶点或生物标志物的作用。

Introduction

肝星状细胞(HSCs)通过激活成肌成纤维细胞来驱动肝纤维化，TGF-b可以激活HSCs。
肝脏是循环系统中IGFBP-3的主要来源之一，可以通过阻断IGF1/2与其受体的相互作用显示生长抑制特性。
IGFBP3与HSCs的激活有关，抑制HSCs的激活可以抑制IGFBP3的转录

结果

HSCs的mRNA测序分析得出IGFBP3是TGF-b的重要靶点基因之一

TGF-b刺激HSCs48小时后进行的测序分析。

通路富集分析显示，根据-logP值的排序，肝纤维化/HSC激活是最靠前的通路。

IGFBP-3对TGF-b反应的上调依赖于支架蛋白GIPC

敲低GIPC和control的细胞，TGF-b刺激2小时，测序

IGFBP-3主要在HSCs中表达

从橄榄油或CCl4处理的小鼠肝脏中提取的单细胞RNA测序分析显示，非实质性肝细胞簇与其他HSC标记基因如和增强的IGFBP-3表达及COL1A1、PDGFRb在同一集群富集，说明IGFBP-3主要在HSCs中表达。

GIPC1敲低后体内外的IGFBP-3的表达都降低了

PCR，ELISA和WB验证敲低GIPC1后IGFBP3的变化。

然后，建立HSCs条件敲除小鼠：Colcre/GIPCfl/fl。发现小鼠的IGFBP3的表达下调了。

结论是GIPC促进IGFBP3的产生和释放。

GIPC通过H3K27乙酰化和甲基化IGFBP-3启动子来调控IGFBP-3的表达

基因表达通常受到P300和赖氨酸27乙酰化组蛋白修饰(H3K27Ac，导致基因激活)和赖氨酸27组蛋白三甲基化(H3K27m3)的调控，从而导致EZH2增强子的基因抑制。

我们对ENCODE TFBS数据库(encode.org)的研究表明，在人类IGFBP-3转录起始位点区域存在2个重叠的EZH2结合位点，另外一个在启动子区域。

基于这个做了一个ChIP实验。结果发现敲低GIPC，IGFBP-3的H3K27me3 repression marks，降低H3K27Ac。

核内H3K27m3增加，H3K27Ac减少。抑制剂抑制p300后，TGF-b诱导的HSCs细胞中IGFBP-3 mRNA水平降低。荧光报告基因的结果也说明敲低GIPC可以抑制IGFBP3启动子的活性。

GIPC全敲除可以降低HSC的激活

用BDL手术诱导肝纤维化。

BDL术后4周，IGFBP-3-/-的小鼠门脉压力，天狼星红染色，肝胶原蛋白含量及a-SMA均比对照组低。BDL手术后WT组的IGFBP-3表达升高，但是全敲除组没有。

然后又做了一个CCL4的肝纤维化模型。

酒精性肝硬化患者中IGFBP-3表达上调

在6个酒精性肝硬化的患者血清中检测IGFBP3的蛋白水平，发现IGFBP-3是显著升高的。

IGFBP-3通过b1整合素信号通路和PI3K/PKB通路促进星状细胞迁移，这需要铁(Fe3þ)作为辅助因子

通过不同浓度的IGFBP-3 (200 and 400 ng/mL)处理HSCs细胞，然后用划痕实验观察细胞迁移。发现IGFBP-3以剂量依赖的方式促进细胞迁移。通过微流体小室培养，用整合素中和抗体，然后用IGFBP-3刺激细胞，观察细胞迁移。发现整合素中和抗体可以阻断IGFBP-3的作用。同时敲低IGFBP-3还可以抑制ki-67，表明其促进增殖的作用。

Discussion

GIPC has been shown to link receptor activation with intracellular signaling and gene transcription. GIPC被证明与胞内信号转导和基因转录相关。
本文的发现

（1）GIPC1通过对组蛋白的表观修饰促进HSCs的IGFBP-3的表达；

（2）在体内实验中，敲低IGFBP-3可以减弱肝纤维化；

（3）肝硬化病人血清IGFBP-3的水平是上调的；

（4）IGFBP-3通过整合素-AKT通路激活HSCs，促进细胞迁移。
前面的研究发现了GIPC1可以影响HSCs细胞受体蛋白的稳定性，功能以及细胞迁移。这篇文章就将GIPC1的机制与下游靶点IGFBP-3的作用联系起来了。
GIPC诱导的IGFBP-3的增加是通过乙酰转移酶p300介导的，该酶负责IGFBP-3启动子区域内H3K27的乙酰化。

Methods

ChIP Analysis

试剂: EZ-Magna ChIP (catalog #17-408; Millipore, Burlington, MA)

(1) Cells were cross-linked with 1% formaldehyde, after which they were lysed and subjected to sonication, then sheared cross-linked to fragment DNA.

(2) After centrifugation, the supernatant was diluted in ChIP buffer.

(3) Samples subsequently were incubated with 5 mg antibody and ChIPgrade Protein A magnetic beads (Millipore) overnight at 4C.

(4) After extensive washing (Low Salt, High Salt, LiCI Immune Complex Wash Buffer, and TE Buffer; Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO), chromatin was eluted, and DNA was purified and analyzed by qPCR.

(5) Fold enrichment was calculated by first normalizing ChIP-qPCR to input DNA of the target gene as a percentage of input.

(6) This subsequently was normalized to the percentage input of a negative control gene region (intergenic region of 36Me3-hCh19) to correct for experimental variation.