基于同源重组的过表达载体构建

P3×FLAG-CMV14-TRIM26质粒构建

1. 载体信息

载体：p3×FLAG-CMV14(C端FLAG)，分子量6310bp，图谱如下：

选择酶切位点：EcoR I: GAATTC；BamH I：GGATCC

2. 引物设计

引物设计，因为选择的方法是无缝克隆（同源重组）的方法，所以在引物两端分别加上15bp左右的同源臂（多克隆位点不算在内），加上酶切位点；同时，FLAG标签是C端的，所以下游引物基因的终止密码子应该去除。引物序列如下：

CMV-26F-F: TAAGCTTGCGGCCGCGAATTCATGGCCACGTCAGCCCCA

CMV-26F-R: TTTGTAGTCAGCCCGGGATCCGGGTCTTAGCAGGAGGCG

3. PCR

PCR反应体系如下：

组分	体积
ddH2O	7.5
2Xbuffer	10
CMV-26F-F（10 nM）	0.5
CMV-26F-R（10 nM）	0.5
DNA模板	1
酶	0.5

程序：

98℃，3 min –> | 98℃，30s –> 60℃，30s –> 72℃，1 min (30 cycle)|–> 72℃，5 min –> 4℃，∞

4. 载体酶切

酶切体系：

组分	体积
ddH2O	14.6
Buffer FD	2
EcoR I	1
BamH I	1
载体	1.4（2 ug）

同时，分别做两个10uL体系的单酶切。跑胶的时候可以把环状质粒作为对照。跑完胶后用胶回收试剂盒进行回收，用20 uLddH2O溶解回收片段。

5. 同源重组

使用碧云天的无缝克隆试剂盒，反应体系如下：

组分	体积
PCR片段	1.25
酶切好的载体	1.25
2X seamless cloning Mix	2.5
总体积	5 uL

50℃金属浴，反应15 min。然后转化涂板。

6. 菌落PCR验证

涂板后12~16小时，挑取单克隆，于10 uL无菌ddH2O中混匀。每个板挑取5个左右的菌落进行PCR验证。可以使用回收的PCR产物作为阳性对照。

PCR验证后，取其中一个中提质粒，测序。